[생화학실험] Using gel filteration to study ligand-protein interaction

 ... 어쩌다가 시간이 벌ㅆㅓ

 얼른 종강하고 졸업하고 싶은 마음과 당장 마주하는 과제와 공부에게서 런하고 싶은 마음이 공존하는즁,,,

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1. 제목 :Using gel filteration to study ligand-protein interaction

 

2. 목적

• phenol red를 사용해 소 혈청 알부민(BSA)간의 결합을 연구해 리간드가 단백질에 결합하는 역할을 이해한다.
• gel filteration을 이용해 염료-단백질 복합체를 분리하고 결합 곡선을 도출함으로써 ligand가 대분자에 결합하는 과정의 정량적 분석을 수행한다. 

 

3. 이론

 1) 리간드 : 단백질과 선택적/비특이적으로 비공유결합을 하는 분자. 비공유 결합성 힘은 수소 결합, 소수성 상호 작용, 반데르발스 힘, 전기적 상호작용 등이 있음

 

(2) 결합의 정량적 분석

 :평형상수(formation constant, kf) : ligand-macromolecule간 결합을 정량적으로 나타내기 위한 중요한 요소. 저 둘간 형성 강도를 나타낸다. 

L+M <> LM이라고 할 때 kf = [LM]/[L][M] 

 

: 단백질은 여러개의 binding site를 가질 수 있다. 각 부위가 차지된 정도를 v라고 했을 때

V =kf[L]/ kf[L]+1 = 리간드 결합 부위 / 단백질의 전체 결합 부위

Michael-Menten 방정식과 유사하며 [L]이 증가할수록 v은 포화에 도달한다. 이 과정에서 결합 곡선을 작성하면 [L]에 따른 결합 부위의 포화 상태를 관찰할 수 있다. 

 

(3) Scatchard equation : kf와 binding site 수 n을 추정하기 위해서 고안된 식. 이를 사용해 모든 부위가 동일하고 독립적인 지선이 나온다. 이 직선의 기울기와 절편을 통해 kf와 n을 추정 가능하다. plot이 직선이면 모든 결합부위가 독립적이고(협동적이지 않아서), 곡선이면 두가지 형태의 결합 부위가 존재한다. 또한 plot을 통해 상수를 추정할 수 있다. y절편에서 결합부위 수를 추정할 수 있다. 

 

(4) gel-filteration(gel exclusion chromatography) : 단백질, 핵산, 효소 등의 전제에 사용되는 크로마토그래피의 일종.

원리 : 고정상의 구멍보다 용질 입자가 작으면 구슬을 통과하게되며 eluting time이 늘어난다. 이로 큰 입자가 빠르게 elute되며 분자 크기에 따라 용질 입자의 분리 시간이 달라진다.

특징 : 리간드-프로틴 복합체가 free ligand보다 더 큰 분자량을 가져서 분자 정제에 가장 이성적인 방법으로 사용된다. 

 

(5) 페놀 레드(phenol sulfonphthalein) : pH지시약으로 사용된다. MW = 354.38. pH 6.8에서 최대 흡광도가 443에서 pH 8.2, 최대흡광도 570으로 서서히 변하게 된다. 

 

(6) 알부민 : 사람과 동물의 혈장에 이ㅣㅆ는 가장 풍부한 단백질

1. 사람 내 전체 알부민의 40%는 수용성 기반 혈장에 녹지 않는 필수 영양분을 운반하면서 순환한다.
2. thyroxine, steroid 호르몬과 같은 물질을 위한 혈장 운송 단백질이다. 
3. 약물과 알부민이 결합하여 활성화 되는 장소로 운반된다. 

(7) 알부민- 페놀레드

• 알부민 1개 분자는 6개의 페놀레드와 결합한다.
• 지방산이 존재할 시 페놀 레드의 결합능은 저해된다. 이는 알부민의 결합자리에서 페놀레드와 지방산이 경쟁하기 때문이다. 
• 알부민-페놀레드 결합은 pH변화에 예민하다. pH 3.0~5.0에서 가장 결합능이 높다. 
• 단백질과 결합한 리간드는 흡광도 변화를 보이지 않으나 비결합 리간드는 v-vis영역에서 높은 흡광도를 보인다. 따라서 단백질 결합 유무에 따른 리간드 분리 작업이 필요하다. 이는 젤 필터레이션으로 가능하다. L-M은 큰 분자량으로 빨리 elute된다. 

 

4. 시약 및 기구 생략

 

5. 실험 방법 생략

 

6. 결과 생략

 

7. 토의 

(1) scatchard eq 유도하기