[생화학실험] Plasmid DNA isolation and characteriaztion by electrophoresis

우리 학과에 그렇게 족보다 나돈다면서요

근데 나는 가진게 없군 ㅎ

아니 근데 족보 없이 나쁘지 않은 성적 받았으니

어쩌면 내가 승리자? 

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1. 제목 :Plasmid DNA isolation and characteriaztion by electrophoresis

 

2. 목적 : E coli를 키워보고 plamid를 증폭해, 두 가지 방법으로 분리해본다. 

 

3. 이론

(1) DNA recombinant : molecular cloning. 복제된 세포에 DNA fragment를 삽입하는 DNA 재조합 기술을 말한다. 많은 hybrid DNA의 복제본이 recipient 세포로 기원했기에, DNA 분자는 복제되었다 볼 수 있다. DNA 재조합 실험 과정은 간략히 아래와 같다. 

• natural DNA를 선택하고 분리해 foreign DNA를 만들기 위한 운반자를 만든다.
• restriction endonuclease(제한효소)를 사용해 DNA carrier의 두 strads를 쪼갠다.  > linearized plasmid.
• foreign DNA 조각을 veicle에 삽입한다 > recombinat or hybrid DNA molecule
• hybrid DNA분자를 복제할 방법 고안.

(2) restriction endonuclease : 제한 핵산 가수 분해 효소. 줄여서 제한 효소. 이중나선형 DNa 내 특정 염기 순서를 인식하고, 염기 순서를 함유하는 이중 나선의 양 쪽 가닥을 특이적으로 쪼갠다. 각 가닥 내 phosphodiester결합을 가수 분해하여 쪼갠다. 

 

(3) DNA ligase : 쪼개진 부위에서 포스포 다이에스터 결합 형성을 촉매한다. 3' oh과 5' 인산기가 자유인 상태여야 작용하며 ligase에 의해 연결된 사슬들은 이중나선으로 존재해야한다. 최종적으로 opening plasmid를 닫는 역할을 한다. 

 

(4) plasmid : 염색체가 아닌 원형의 DNA. 보조 염색체로 2중나선 구조를 가지고 있으며 염색체보다 작다. 복제 시 2가지로 구분이 가능하다. 

• stringent replicated plasmid : 몇 개의 복제만 가능하다
• relaxed replicated plasmid : 여러개의 복제가 가능하다. 숙주세포에 항생물질이 작용해 염색체 복제가 불가능 할 때도 복제가 가능하다. 숙주의 개시단백질과 독립적을 DNA 복제가 가능하다.

또한 아래 조건 하에서 플라스미드가 복제될 수 있다.

• relaxed fashion이어야 한다.
• 플라스미드가 작아야 한다. 이는 큰 DNA와 분리가능하고 물리적 손상없이 다루기 쉽기 때문이다. 제한효소를 사용할 수 있는 부위가 한정되어 있다. 
• 인식가능한 부위인 마커가 있어야 한다.
• 오직 하나의 cleavage site가 있어야 한다.

(5) plasmid DNA isolation : 다음과 같은 이유로 plasmid를 분리해야 할 때가 있다.

• 재조합 plasmid의 구조상 이유.
• 아가루스 젤 전기용동을 통한 분자 크기 분석
• 제한효소 digest와 map을 전기영동을 통해 분석 시
• 시퀀스 연구 시 

(6) plasmid DNA는 염색체 DNA와 구조상 차이가 있다. 

• plasmid DNA는 항상 닫힌 원형으로 존재하고 염색체 DNA는 shared 선형 구조이다.
• plasmid DNA가 염색체 DNA 보다 훨씬 작다. > 구조적 차이로 물리화학적 차이가 생기게 된다. 

(7) 어떻게 plasmid DNA를 염색체 DNA와 분리하는가?

• plasmid DNA-고체 간 상호작용 이용
• 염색체 DNA의 선책적 precipitation > plasmid DNA의 pH, T, 변성제 저항성을 이용한다. 
• 두 DNA의 침강을 이용한 방법. 

(8) agarose gel electrophoresis

 :plasmid와 같은 작은  DNA 분석에 표준방법으로 사용된다.  사용 용이성, 민감성, 높은 분해능, MW의 넓은 범위가 분석가능하다는 장점이 있다. 

 : 아가루스 젤 농도에 따라 핵산의 이동성이 달라진다. 농도가 낮으면 큰 DNA 분자 분석이 가능하다. 

 

 

4. 시약 및 기구 생략

 

5. 실험 방법 생략

 

6. 결과 

 마커 옆 1번이 원하던 target이었다.

 

7. 토의 

(1) 전체적 과정 정리

• annealing: 달구기. 핵산의 분리된 상보적 가닥을 melting t 이하로 내려간 온도에서 자발적으로 재회합하여 이중나선을 형성하는 것. 이 실험에서 primer간 이중나선 형성을 뜻한다. 일반적으로 55도에서 30초~ 60초. 잘 되었는지 유무는 agarose gel로 확인
• insert DNA extraction: DNA를 잘라내고 target(1번)을 삽입하는 것. 이떄 DNA는 restriction enzyme을 사용해 cutting 한다. 이때 쪼개지는 자리는 두 겹 회전 대칭성(two fold rotational symmetry)가 인식되어 쪼개진다. 쪼개질 떄 complementary-single stranded end(cohensive)가 생기며 이로 부착성 말단이 동일할 시 plasmid 내에 삽입할 수 있게 된다. 
• ligation : DAN ligase는 DNA cohensive -target 간 포스포다이에스터 결합을 촉매한다. 이로 둘은 연결되며 원형의 플라스미드가 된다. 이때 free 3'-oh와 5'-phosphate 기가 있고, 이중나선으로 연결되어야 ligase가 일어난다. 
• transformation : bacteria cell이 원래 가지고 있지 않는 DNA를 삽입하는 단계. heat shock와 electroporation 두 가지 방법이 있다. 
• expression at agar plate : agar plate에서 DNA삽입된 대장균/박테리아를 기르는 과정이다. 여러 항생제 성분이 플레이트 내에 있는데 이는 target 외의 타 균을 배제하기 위함이다. 따라서 target DNA내에는 항생제 내성 DNA가 염기서열 내에 존재한다. 
• colony culture : colony를 선별/채취/재배양하는 방법. single colony를 채취하는데 이는 1 콜로니 = 1 livecell의 결과로 해석하며, 세균수 측정 단위인 cfu(colon forming unit)을 계산/유전적 동일성을 고려하기 위함이다. 채취한 콜로니는 용액 내에서 재배양한다. 
• restriction & agarose gel : target의 삽입을 확인하기 위해 restriction 해 cell을 제거한 뒤 agarose gel로 확인하는 단계이다. 

(2) PCR : polymerase chain reaction 의 약어. DNA의 원하는 부분을 복제, 증폭시키는 분자 생물학적인 기술이다. 

• strand separation : 이중나선 구조인 DNA 분자를 95도씨에서 15초간 중탕하여 분리한다.
• hybridization of primer : 용액을 54도로 냉각시켜 프라이머를 DNA가닥에 혼성체화한다. 2개의 시발물질은 3'와 5' 끝에 각각 혼성체화한다. 프라이머는 미량으로 존재. 20~30개의 nucleotide 길이이다. 
• DNA 합성 : 중합효소의 최적온도인 72도로 올려 5'부터 3'으로의 합성을 한다. 주기를 반복할 때 마다 2배씩 증폭된다. 

(3) 용어

 원형 plasmid > cut > 기존 dna는 vector, 삽입은 insert/target 등으로 불림.